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免疫熒光實驗操作步驟(Immunofluorescence,IF)

發(fā)布于 2023-08-21


免疫熒光(Immunofluorescence, IF)染色是一種廣泛應(yīng)用于生物學研究和臨床診斷的技術(shù)。IF利用熒光標記抗體檢測特異性靶抗原。染色成像非常直觀,可以直接觀察結(jié)果。雖然這是一個成熟的技術(shù),但必須考慮多個因素,并采取各種優(yōu)化步驟,以確保染色成功。

實驗步驟:


培養(yǎng)細胞的免疫染色


除非另有說明,所有步驟均在室溫下進行。為了獲得最佳染色效果,除非使用的細胞系很脆弱(例如神經(jīng)元細胞),否則應(yīng)在緩慢移動的旋轉(zhuǎn)搖床上進行操作。

一、固定和通透:

吸取培養(yǎng)基,用1X PBS(Cat No. PR20023)清洗接種在干凈蓋玻片上的細胞。

用新鮮的4%多聚甲醛在1X PBS中固定細胞15分鐘。

用1X PBS沖洗蓋玻片3次,每次3分鐘。 

在1X PBS中用0.2%Triton X-100滲透5分鐘。

用1X PBS沖洗蓋玻片3次,每次3分鐘。

二、封閉:

在1X PBS中制備5%正常血清的封閉溶液。從產(chǎn)生第二抗體的同一物種中選擇血清,例如,如果第二抗體是山羊抗小鼠,則應(yīng)選擇山羊血清作為封閉液。

將細胞與封閉溶液孵育1小時(或者,如果沒有相應(yīng)的血清,則使用1X PBS中的3%BSA進行封閉。)

三、抗體孵育:

吸取封閉液,在抗體稀釋緩沖液中稀釋一抗。設(shè)置空白對照(在不加一抗的抗體稀釋緩沖液中培養(yǎng))。常溫孵育1小時,或者,在4°C的溫度下孵育過夜.

請注意:如果隔夜孵育,請采取措施確保蓋玻片不會變干。

用1X PBST(Cat No. PR20024,含0.1%Tween)清洗樣本3次,每次5分鐘。

加入用抗體稀釋緩沖液稀釋的適量的熒光二抗,并在潮濕、黑暗的環(huán)境中室溫孵育1小時。

請注意:加入熒光二抗后,實驗樣本必須盡可能保持在黑暗條件下。

用1X PBST(0.1%Tween)清洗樣本3次,每次5分鐘。

四、封片和鏡檢:

用含DAPI(如果需要)的封片劑將樣本封固在載玻片上。

在熒光顯微鏡下檢查載玻片。

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